一、糖生物学概述  

      在20世纪 50年代早期，Francis Crick提出遗传信息沿着从 DNA到RNA到蛋白质的方向单向传递，即DNA产生RNA, RNA产生蛋白质，这就是著名的分子生物学的中心法则。此后该理论不断被完善，由此分子生物学有关蛋白质的研究取得了突飞猛进的发展。事实上，细胞的形成还需要两种重要的物质:脂类和糖类。它们可以作为产生能量的媒介，也可以作为信号分子，还可以作为结构组分。特别是糖类，在构成复杂的多细胞生物体方面尤其重要，因为这些复杂的多细胞生物体需要细胞和细胞之间、细胞和周围基质之间的相互作用。事实上，自然界中所有细胞和大多数大分子是依靠糖链组成复杂的结构体。  

      在二十世纪初，化学界、生化界和生物界就表现出对糖生物学的兴趣。但是，在分子生物学发展的早期，对多糖(glycans)的研究远远落后于对分子中其他重要成分的研究。这很大程度上与多糖内在结构复杂、难以测序、其生物合成不是直接利用DNA模板得到的有关。近年来，一系列新技术的发展为探索这些糖链的结构开辟了一条新途径。1988年，Rademacher、Parekh和Dwek提出将这门分子生物学中的新学科称为糖生物学(glycobiology)，他们用糖类在细胞分子生物学最新的观点认识它在化学和生化这两门传统学科中的内容。从广义上讲，糖生物学研究的是在自然界广泛存在的糖类的结构、生物合成和生物特性。糖类与其他种类的化学成分以共价键的方式组成各种类型的复合物被归类为复合糖(glycoconjugates)，它包括糖蛋白、糖肽、糖脂、肽聚糖、脂多糖等。   

     本章主要讨论糖蛋白和它在类风湿关节炎中的作用。

二、糖蛋白的结构和功能  

      肽链通过共价键和寡糖链(或糖基)结合的蛋白质称为糖蛋白(glycoprotein)。寡糖[注]是由2～10个单糖单位通过糖苷键连接起来的，在糖蛋白中呈线形或分支状，分支状寡糖中至少包括20个单糖残基。糖蛋白中糖的含量差异很大，糖占糖蛋白分子重量的1%～85%。糖蛋白形成的过程称为糖基化(glycosylation)。

      糖蛋白是在生物体中存在的复杂糖类(糖缀合物)的一种。糖蛋白的存在很广泛，如人血浆中除了白蛋白之外，其他各种蛋白质都是糖蛋白，许多细胞膜蛋白也含有糖的成分，多种激素也是糖蛋白，糖蛋白中的糖链组成还与血型有关。此外，糖蛋白的糖链与肿瘤的细胞转移现象，与异体器官移植中的免疫排斥有关，由此可见糖蛋白不仅具有重要的生理学功能，而且对病理学变化以及诊断有重要意义。表14一1列举了糖蛋白的功能。

（ [注]：1996年在IUPAC-IUB有关生化命名的联合会议上，寡糖是这样定义的:寡糖是以单糖为单位，通过糖苷键连接的复合物。按照单糖的数量，它们可以被称为双糖、三糖、四糖等，因为多糖中单糖的数量限定很不严格，所以寡糖中单糖数量的上限没有明确规定，一般指相对于尚未明确长度的聚合体或相应的混合物，寡糖具有明确的结构。）

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     许多研究证实了糖链在糖蛋白功能中的作用，认为寡糖链编码了糖蛋白的生物学信息，这主要与寡糖的成分、序列和构成有关。表14一2总结了寡糖链的各种功能，其中有的功能已经确定，有的还在进一步研究中。

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三、寡糖链的组成、连接和结构   

      糖类可以分为单糖、双糖、寡糖、多糖及它们的衍生物。单糖是多糖的基本结构单位，目前已经发现有二百余种单糖。构成人类糖蛋白分子的单糖主要有8种:葡萄糖(Glc )、半乳糖(Gal)、甘露糖 (Man)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc), N-乙酰神经氨酸(NeuAc )、岩藻糖(Fuc)和木糖(Xyl) 。(表14一3)   

       按这些单糖构成的寡糖与蛋白质的连接方式糖蛋白可分为三种主要类型(图14一1)：   

       (1)O-连接糖蛋白:其肽链中含有羟基的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr )，和糖(如Ga1NAc)通过O-糖苷键连接。   

       (2) N-连接糖蛋白:其肽链中的天冬酰胺(Asn)的酰胺氮和糖通过N-糖苷键连接。

       (3 )GPI连接糖蛋白:是通过肽链羧基末端的氨基酸与糖基磷脂酰肌醇锚的寡糖部分结合。

        糖蛋白的生物学作用与寡糖链的结构有关，尤其是其糖链的末端糖基常对功能起决定性作用。目前对 N-连接糖蛋白的研究和了解较多，大多数比较易于得到的糖蛋白包括膜蛋白和血液循环中的蛋白质都是这种类型。通过N-连接和肽链相连的寡糖链称为N-连接寡糖，按其糖基的组成主要分复杂型、杂合型和高甘露糖型三种类型。这三型N-连接寡糖都有一个五糖的核心结构，高甘露糖型在核心五糖上连接了2～9个甘露糖;复杂型在核心五糖上可连接2、3、4或5个分枝糖链，宛如天线状，天线的末端常连有N-乙酰神经氨酸;杂合型则兼有二者的结构。如前所述，N-连接寡糖中的N-乙酰葡糖胺与多肽链中天冬酰胺残基连接，还需要一定的条件，即只有在特定的氨基酸序列中，即Asn-X-Ser/Thr(其中的X可以是脯氨酸以外的任何氨基酸)3个氨基酸残基组成的序列子(sequon)才有可能，这一序列子被称为糖基化位点。一个糖蛋白分子中可存在若干个序列子，但它实际能否与寡糖连接还取决与其周围的立体结构。

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      通过O-连接和肽链相连的寡糖链称为O-连接寡糖，常是由N-乙酰半乳糖胺与半乳糖构成核心二糖，核心二糖可重复延长及分支，再连接上岩藻糖、N-乙酰葡糖胺等单糖。其多肽部分的糖基化位点还不清楚，但通常存在于糖蛋白分子表面丝氨酸和苏氨酸比较集中且周围常有脯氨酸的序列中。粘蛋白中含有大量的O-连接寡糖，而且O-连接寡糖常以簇集的形式存在。

四、寡糖链的合成   

      糖蛋白分子包括多肽与糖两部分，其中多肽部分按一般的蛋白质生物合成在粗面内质网内进行，在此主要介绍其寡糖链部分的合成。各种糖链的合成方式有所不同，以下简要介绍N-连接与O-连接寡糖链的合成。N-连接寡糖是在粗面内质网和高尔基体中合成的，是与蛋白质肽链合成同时进行的共翻译过程。在内质网上以长萜醇作为糖链的载体，在糖基转移酶的作用下，以核苷酸糖(如UDPGlcNAc、CMPSia、GDPMan等)为供体，先将其中的糖基转移到长萜醇，然后再逐个添加上糖基。每一步反应均由特异的糖基转移酶催化完成，直到形成含有14个糖基的长萜醇焦磷酸寡糖结构，此含14个糖基的寡糖(G-寡糖)作为一个整体再被转移到多肽链糖基化位点中天冬酰胺残基的酰胺氮上形成N-糖苷键。寡糖链还依次在内质网和高尔基体中被加工，先后由糖苷酶(糖基的水解酶)水解除去葡萄糖和部分甘露糖，再由糖基转移酶催化加上不同的糖基，最后才生成成熟的各型N-连接寡糖(图14一2)。

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     O-连接寡糖的合成与N-连接寡糖不同，O-连接寡糖合成是在多肽链合成后进行的，而且没有糖链载体。在Ga1NAc转移酶的作用下，将UDPGa1NAc中的Ga1NAc基转移到多肽链的丝氨酸(苏氨酸)的羟基上，形成O-连接，然后逐个加上糖基，每一种糖基都有其相应的专一性的糖基转移酶。整个过程在内质网开始，在高尔基体内完成。  

      糖苷键合成的中心步骤是糖基转移酶的作用，它与对应的底物之间有高度特异性，即对供体核苷酸糖与受体之间的定位相当准确。糖基转移酶的催化作用通常是可逆的，但是对IgG则不然。有研究认为糖基转移酶的连续排列能够提高生物合成的效率。通过糖基转移酶的连续作用得到寡糖链和糖基的结构，这种结构反映了糖基转移酶系统的组成。

      在寡糖链的合成中还需要多种糖苷酶(glycosidases)，它们对作用的部位具有特异性，现已证实糖苷酶对糖蛋白结构和功能的检测很有帮助。这些酶作用于寡糖链远端的称为外切糖苷酶，作用于靠近肽链端糖链的称为内切糖苷酶。外切糖苷酶有神经氨酸酶和半乳糖苷酶，它们可以将大多数糖蛋白糖链末端的NeuAc和Gal移走。内切糖苷酶有内切糖苷酶F和内切糖苷酶H，它们可以特异性的切除靠近肽链的GlcNAc 。  

      总的来说，寡糖链的合成需要以下因素的参与:①需要有功能性糖基转移酶在细胞内合适位置的表达。②需要有核苷酸糖的合成并移位至高尔基体内。③对细胞内受体底物进行合适的加工。④没有其他抑制因素如糖基转移酶抑制剂的影响。

五、生理和病理情况下寡糖链的变化   

      生理条件下，不仅在不同物种的同一种细胞中其糖蛋白大有不同，即糖蛋白具有种属特异性;同一个体的不同组织的糖蛋白也不相同，即有组织特异性;同一种组织不同的细胞、甚至相同的细胞在不同的分化时期或在细胞繁殖周期的不同阶段，糖蛋白的糖链结构也会有所改变，即具有阶段特异性。胚胎发育中就有阶段特异性的寡糖抗原表达。如果糖蛋白的肽链相同，仅其糖链结构有所不同，这称为糖蛋白的不同糖形(Glycoform)。糖形影响糖蛋白的功能。  

      病理条件下，糖蛋白糖链的改变常有重要的病理学意义。炎症时局部血管内皮细胞表面的糖蛋白(或糖脂)末端糖基的变化，可引起炎症细胞的聚集;肿瘤细胞表面糖链的改变可能与肿瘤的转移有关;一些糖蛋白或糖脂的糖链合成异常是遗传病的病因;异体器官移植由于供体细胞的糖链与受体不合而引起严重的免疫排斥。总之，糖链结构变化的病理意义在研究中受到了人们极大的关注。

六、研究糖蛋白的实验室方法   

      与核苷酸和蛋白质不同，糖链很少以线性和无分支的形式表达。正因为这样，糖链可以受到多种形式的修饰，所以用单一的方法难以完成对寡糖的测序，必须组合多种物理和化学方法，才能得到明确的糖链结构。

      从糖蛋白的发现、纯化到结构分析，研究人员经过相当艰辛的过程才逐步建立起糖蛋白的分析方法。纯化蛋白或酶的传统方法对糖蛋白的纯化同样适用，比如盐析法、亲和层析法、离子交换法等。一旦糖蛋白被纯化得到，可以用多种HPLC法测定各种寡糖成分所占的比例，用质谱分析法(mass spectroscopy)、高分辨磁共振光谱分析(high-resolution NMR spectroscopy)识别糖链的结构。在这过程中还可以使用其他的研究工具和方法，比如内、外切糖苷酶，凝集素，化学的修饰和裂解，代谢性放射标记，糖基化抑制剂和激动剂，抗体，糖基化转移酶的分子克隆以及对完整的细胞和有机体进行基因操作等。

七、凝集素在糖蛋白中的作用

      凝集素是一种无免疫源性的糖连接蛋白，它可以凝集细胞和沉淀复合糖。凝集素在生物界分布很广，不仅存在于植物的各组成成分中，而且存在于真菌、细菌、病毒、各种动物乃至人体的各种组织和器官中(表14一4)。它主要有以下几个特点:①一个凝集素至少包括两个糖结合位点。如果它只有一个糖结合位点，那么它将无法凝集或沉淀那些含有糖基结构的蛋白，也就不能称其为凝集素。②凝集素的特异性通常是由单糖或寡糖与其之间的相互作用决定的。③凝集素可以出现在多种类型的生物体内，它们以可溶性的形式存在或是被整合到细胞膜中，本身也可以是糖蛋白。④如果具有多个糖结合位点，糖特异性酶、转运蛋白和毒素都有可能成为凝集素。通常凝集素与酶的作用方式不同，它们与作用的物质不发生催化反应，所以至今它们的生理功能还不清楚。不过有一点无人反对，就是凝集素是“糖编码的译码器(decophers)”。    -

      正因为凝集素具有以上的特点，所以它的应用十分广泛，凝集素在糖蛋白中的作用主要有:①用于纯化和分析糖蛋白，如凝集素刀豆素A(ConA)以共价形式联合在层析柱材基质上(比如琼脂糖)，组成ConA-琼脂糖层析柱，通过糖蛋白中的寡糖链与ConA结合，可以得到纯化的糖蛋白。②作为探针检测细胞表面特异性糖链。因为凝集素可以识别特异性糖链，所以一般来说，它们能够作为探针识别暴露于细胞表面的糖基。

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