类风湿关节炎的干细胞移植及基因治疗 

    类风湿关节炎(RA)是一种发病机制尚不十分明确的自身免疫性疾病，许多学者认为T淋巴细胞在RA的异常免疫反应中起主导作用。据统计，RA在我国的发病率为0.32-0.36%，因此有一个十分庞大的患者群。而目前包括非甾体类抗炎药、慢作用抗风湿药甚至新型生物制剂在内的RA的治疗方法均无满意的疗效，致使本病有相当高的致残率,给患者本人及整个社会都带来很大的经济负担。近年来文献报道造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)和基因治疗(Gene Therapy)有可能从根本上治愈RA，给RA患者带来了新的希望。本文对造血干细胞移植及基因治疗的现状作一概述,并简要介绍我院在这两方面所进行的工作，以探索RA治疗的新途径。
　　一、 造血干细胞移植：
　　　　造血干细胞移植传统上用于治疗急性白血病、淋巴瘤等危及生命的疾病。随着技术方法的不断成熟和安全性的提高，其适应症已扩展至其他疾病，成为血液系统疾病、实体瘤、自身免疫病(AID)和基因缺陷疾病的重要治疗手段。其中，自身免疫性疾病因病程迁延、致残率高、患者生活质量差且无理想的治疗方法而成为干细胞移植治疗的一大类疾病。动物实验已证实，HSCT可从根本上治愈AID[1]；临床上也有较多资料表明HSCT成为某些严重AID的有效治疗手段［2、3］。HSCT根据干细胞的来源不同分为异体HSCT和自体HSCT，尽管已有报道异体HSCT可根治AID，但由于其移植相关死亡率较高，自身免疫性疾病的造血干细胞移植多采用自体外周血干细胞移植。截止到2001年5月，在EBMT/EULAR(European Group for Blood and Marrow Transplantation / European League Against Rheumatism)注册的接受外周血干细胞移植(PBSCT)的患者已达350例，包括多发性硬化、系统性硬皮病、系统性红斑狼疮、幼年特发性关节炎及RA等，其中RA患者有43例。这些接受PBSCT的RA患者有的得到了较长期的完全缓解，也有复发的报道。但无论如何，对于传统治疗方法，甚至最新出现的以肿瘤坏死因子－α(TNF-α)颉颃剂为代表的生物治疗都无反应，病情持续进展的难治性RA来说，HSCT仍是最有希望的治疗措施。
　　　　PBSCT治疗RA基于以下三点临床观察：1、骨髓摧毁性破坏的RA患者在接受异体骨髓移植后病情得以缓解；2、合并有其他恶性疾病的RA患者接受自体干细胞移植后病情明显改善；3、RA并非一良性的致畸型疾病，其死亡率显著高于正常人群［4］。由于T细胞介导的异常的自身免疫反应是RA发病的重要因素，因此HSCT治疗RA的合理性即在于RA自身免疫的发病机制以及其对免疫抑制剂的治疗反应性。目前认为，HSCT 诱导RA缓解的机理包括以下几个方面：1、RA的发病需要多种及多亚群的淋巴细胞参与抗原的递呈、识别和反应，而预处理方案的应用使其功能发生障碍,甚至凋亡, 即摧毁了自我攻击性淋巴细胞克隆，从而抑制了炎症反应，起到使疾病短期缓解的作用；2、通过去T的HSCT，即回输给患者高纯度的CD34+细胞，尽可能减少移植物中异常的淋巴细胞克隆，可最大限度地减低T细胞激活所造成的异常免疫功能状态，减低复发的可能；3、HSCT后免疫重建是疾病长期缓解的基础[5]。免疫重建一般发生于移植后半年，主要为细胞免疫的重建，淋巴细胞各亚群的重建不同步，B淋巴细胞约于移植后6-12个月恢复，而T淋巴细胞需1-2年才能恢复正常，如CD4/CD8淋巴细胞比例倒置可持续至移植后两年。在免疫重建过程中患者的免疫调节可能达到新的平衡或产生免疫耐受，即对自身抗原决定簇产生耐受，从而导致无反应性和／或自身反应程度的下降，使RA得以治愈。RA患者在接受PBSCT后,已破坏的关节在免疫重建中提供新的抗原,能通过负选择而产生免疫耐受[6]。但由于RA的病因并不是单因素的，因此APC MHCII基因型、骨髓的微环境及生存的环境未改变,RA仍有复发的可能，HSCT后病情的复发可能还有以下原因：自身攻击的淋巴细胞克隆继续存活；自身反应的淋巴细胞克隆再回输；患者原有自身抗原的持续刺激等。这些问题的解决尚有待于更深更广的研究。
　　　　我院自2001年开展了HSCT治疗难治性RA的前瞻性I期临床研究。选择药物治疗失败而无不可逆性内脏功能受损的RA患者作为研究对象。入选标准包括：年龄≤60岁；患者为复发性、难治性RA，4种或4种以上的二线药物治疗无效；无严重的不可逆的内脏器官受损：(1)心：左室射血分数(EF)≥45％ (2)肺：肺功能检查示通气及弥散功能正常 (3)肾：血肌酐(Cr) ≤1.5mg/dl (4)肝：肝功能指标正常 (5)骨髓造血功能正常；签署知情同意书。技术路线包括造血干细胞动员、采集、CD34+细胞分选(去T)、干细胞冻存、预处理及干细胞回输。移植后观察肿痛关节数、关节功能、关节X线检查等临床指标的变化，用ACR20、ACR50、ACR70标准对患者的疾病活动程度进行评估。本研究的先进性主要有以下几点：1、细胞分选技术：患者所回输的干细胞均是经过最新的ClinMACS分选技术分选所得的高纯度的CD34+细胞，这一过程中T细胞去除达3-4个对数级，最大限度地减低T细胞激活所造成的异常免疫功能状态，减低复发率；2、预处理方案：应用目前国际上公认的最佳预处理方案：CTX+ATG，其中CTX用量达200mg/kg，ATG为90mg/kg。这样的方案可最大程度上摧毁机体的异常免疫系统，清除自身反应的淋巴细胞；3、淋巴细胞表型分析：在移植前后对患者进行外周血的淋巴细胞表型分析，一方面可了解患者的免疫功能状态，为临床预防和控制感染提供依据，另一方面可监测移植后的免疫重建，了解RA长期缓解过程；4、将动员后获取的造血干细胞进行体外培养，在其不同的分化阶段检测其免疫功能，在干细胞水平探索RA的发病机理。
　　　　目前我院已完成1例难治性RA患者的干细胞动员、采集、分选、预处理及回输等HSCT全过程，至今已随访10个月，病情平稳。此患者是一位29岁女性，自7年前出现反复多关节肿痛、晨僵及间断发热，查类风湿因子(RF)高滴度阳性，血沉(ESR)增快，符合1987年美国风湿病学会RA分类标准。患者正规应用非甾体类抗炎药、强的松(Pred)、甲氨蝶呤(MTX)、环孢菌素A(CsA)、氯喹等治疗，且曾经多种免疫抑制剂联合应用，病情均未能得以控制，未达到ACR20标准，病程中逐渐出现了双手关节的骨质破坏及双腕关节融合。因反复治疗效果不佳，且患者有生育要求，多种药物应用受限，故考虑行大剂量化疗及外周血干细胞移植。自2001年3月15日干细胞动员到5月18日大剂量化疗(预处理)后干细胞回输，整个过程顺利，无并发症发生。现随访已满10个月，患者关节肿痛消失，ESR、CRP降至正常，RF转阴，已达ACR70标准，且已停用所有免疫抑制剂。目前能从事正常工作，生活质量明显提高。
　　二、基因治疗：
　　　　基因治疗是指为了治疗目的，将新的遗传物质导入机体细胞的疗法［7］。理论上讲，任何能抑制RA病理的分子都是基因治疗潜在的目标［8］。由于自身反应性T细胞在RA的病理生理中起主导作用，而细胞因子又是介导这些免疫反应的介质，所以，目前RA基因治疗的靶基因主要针对这些细胞因子，包括抗炎症、免疫反应的白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1 receptor antagonist，IL-lRa)和可溶性肿瘤坏死因子受体(soluble TNF receptor，sTNFR) ；调节免疫反应的IL-4、IL-10、IFN-β；诱导细胞凋亡或抗滑膜增生的FasL以及黏附因子等等［9.10］。
　　　　目前，RA的基因治疗在关节炎动物模型中进展较快，大部分RA动物实验采用了局部基因治疗。已研究的载体包括：①小鼠白血病病毒(murine leukemia virus，MuLV)：MuLV逆转录病毒是在所有RA动物基因治疗中最常用的载体，应用兔膝关节作为模型，MuLV载体可使导入的IL-lRa基因表达6周。②慢病毒和腺病毒相关病毒(adeno-associated virus，AAV)：二者可整合到人染色体上，能够将治疗基因导入关节滑膜表达。③腺病毒和单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)：可以获得高水平的基因表达。但是，第一代的腺病毒载体会引起炎症，而HSV载体则有细胞毒性。在临床试验方面，世界上第一例RA基因治疗的临床实验是1996年7月经美国FDA批准在匹兹堡医学中心进行的，目前已成功完成了9例RA患者局部基因治疗的I期临床试验，初步结果显示将治疗基因在RA关节导入、表达，是安全的和可行的［11］。
　　　　我院已于2001年开展了RA基因治疗的动物实验，拟通过动物实验，建立并完善治疗RA的基因转移方法，为将来进入临床试验奠定基础。技术路线包括：(1)建立RA动物模型：将MFG-hIL-1β基因转移至兔膝滑膜，使其组成性表达hIL-1β，产生与人RA极其相似的病理改变。此模型以IL-1β为炎症抗原，与RA的发病机制密切相关。(2)采用先进的离体基因治疗方法，进行兔膝关节炎基因治疗的研究。(3)将逆转录病毒携带的治疗基因导入RA关节，使其选择性地到达靶组织并持续表达，为将来的临床试验奠定基础。截止到目前，我院已建立MFG-hIL-1β-neo重组体转染HIG-82细胞系导致严重滑膜炎的兔RA动物模型，正在进行人IL-1Ra基因腺病毒重组体直接体内基因转移治疗RA的动物实验；已成功培养正常兔自体原代滑膜成纤维细胞，细胞生长状态良好，可用于离体基因治疗时体外病毒转染。
　　　　RA作为一种至今发病机理不明、治疗效果不佳、致残率很高的自身免疫性疾病，至今无满意的治疗药物：传统的慢作用抗风湿药副作用大，患者耐受差；新型的生物制剂费用昂贵、不能口服、体内清除快、靶向性差。而造血干细胞移植和基因治疗从理论上可能克服以上缺陷，是两种新的非常有前途的治疗手段。而从干细胞水平和基因水平研究RA患者的免疫功能，将对RA发病机理的探索开辟新的途径，有很好的研究前景。