正常的关节液较难得到，即使在人体最大的关节— 膝关节，也仅能获得几滴滑液，最多不超过4m1。如果经过多次努力抽吸或者手法挤压后在注射器中没有发现滑液，可以保持持续抽吸拔出穿刺针，有时针头上会留有一滴滑液或者组织液。应用这一滴滑液(约0.05m1)可以进行晶体检查、革兰染色或者细菌培养，如果有相差显微镜，还可以确定白细胞的主要类型、浓度和形态分类。如果没有抽吸到液体，又怀疑有感染存在，可以向关节内注人少量生理盐水后再抽出，做细菌培养。所有的化验都应该在一份标本上进行，而且关节液要立即进行检查，因为在几个小时内白细胞计数会下降，晶体可以自行形成。

   一、大体检查   

      关节穿刺抽取滑液以后，应该立即进行大体检查，将滑液初步进行分类(正常、非炎性、炎性、化脓性或是血性)，但是根据大体检查很难确定特异性的诊断，所以应该马上进行其他项目的检查。   

      1.体积   

      关节积液的体积是检测关节炎严重程度的一项指标，可与以前的关节穿刺结果进行对比。有时关节内存在较厚的纤维素、米粒样物体或者碎屑，关节液很难抽出来;而有时关节液局限性分布，用常规的方法抽吸不出来。所以，少量关节液并不意味着没有严重的关节疾病。   

      2.凝块形成   

      正常的滑液因为缺少纤维蛋白原、凝血酶原、V和w因子、组织型凝血活酶和抗凝血活酶，所以不会形成凝块。但是，在许多病理条件下，滑液会凝集。凝集的速度和凝块的大小与炎症的严重程度有关。因此，滑液采取后要按50单位//ml迅速加人肝素抗凝。   

       3.粘滞度   

      目前人们认识到，评估关节液的粘滞度对关节炎的分类不如以前想像的那样可靠。滑液粘滞性可以通过观察滑液缓慢流人注射器或者用戴有手套的拇指和食指捻摸来感觉。正常滑液的粘滞度适中，牵拉长度不超过2-5厘米。低粘滞性的滑液可以像水一样从注射器中流出。甲状腺功能低下、骨关节炎粘液样囊肿和键鞘囊肿中经常存在高粘滞度的滑液。一般情况下，炎性积液的粘滞度降低，如表31一1所示;组织水肿时滑液的粘滞性也下降;在化脓性积液中，大量的白细胞使关节液粘稠度增加。对高粘滞性滑液要进行其他实验检查，需要用透明质酸酶或者生理盐水来稀释，目前应用此酶的正常参考值已标准化，盐水稀释情况下只需要考虑稀释倍数就可以了。   

       4.颜色和透明度   

      如果滑液不透明，或者关节积液表现浑浊，往往提示炎性病变。需要在显微镜下检查确定是否存在晶体、脂质或者其他淀粉样物质。慢性的炎性关节液有时含有米粒样物，可能会与脓相混淆。米粒样物是滑膜增生和变性的结果，其中含有胶原、细胞碎屑和纤维素成分。

      褐黄病的液体可能会被暗色颗粒形成暗色斑点;关节假体的材料如金属或者塑料磨损的颗粒也会导致滑液颜色改变。   

      色素绒毛结节性滑膜炎的关节液大多呈血性，也可能呈桔黄色。含有尿酸盐或者碳酸盐结晶的关节液可能是白色、黄色或者糊状。含有胆固醇的关节液可能是黄色的，有时关节穿刺伤及血管时会在关节液中残留一些血丝，而真正的血性关节积液因为纤维蛋白溶解不会发生凝集。血性关节液常见于以下疾病，如表31一3所示。关节液离心后表面漂浮的脂滴可能由于骨折累及关节腔所致。

      

31-3.jpg

       5.粘蛋白凝集实验   

      尽管可以采用很多方法检测滑液中的透明质酸含量，但是粘蛋白凝集实验是最为实用的定性方法。根据透明质酸的聚合程度，将凝块形成结果分为良、中、差三级。滑液离心后将上清移到玻璃管中，加人几滴冰醋酸，透明质酸蛋白发生凝集，形成沉淀物，摇晃试管，沉淀仍然保持完整则为良。如果滑液量有限，可以取1份滑液，加人4倍体积的2%醋酸来进行粘蛋白凝集实验。大多数炎性关节液的粘蛋白凝集实验结果不佳，目前尚不清楚原因。据推测可能与蛋白浓度增高、a胰蛋白酶抑制剂和透明质酸复合物形成、透明质酸聚合体降解和滑膜细胞合成透明质酸减少等因素有关。在体外实验中，只有过氧化物自由基可以降解透明质酸，但是在RA中没有发现透明质酸降解以后产生的分子量约13.5kD的降解产物。

   二、滑液镜检表31-4 相对的非炎性关节液  (WBC计数低于 1000 /mm3 )   

      1.白细胞计数   

      白细胞计数是关节液分析的一个重要部分，因为这是将关节液分类为化脓性、炎性或者非炎性积液的一个重要依据。可以连续取样做滑液的白细胞计数，粗略估计炎症程度。   

      一般应用标准的白细胞计数板来进行细胞计数，计数液采用生理盐水稀释或者0.3%的盐水来裂解红细胞。常规的计数液为酸性，可以使滑液发生凝集，细胞计数结果不准。小量的滑液应该放在肝素管中混匀后马上计数，因为白细胞会自然凝集成团块。加人美蓝有助于识别白细胞。在多数正常关节液中，白细胞数目通常在50一100/mm 3，白细胞计数在200一2000/mm 3之间者应该考虑非炎性关节病。白细胞少于1000/mm 3者，最多见原因是骨关节炎，其他常见的原因详见表31一4。退行性关节疾病的患者，例如血色病，如果有钙质沉着，形成晶体诱导的关节炎，就会产生炎性关节积液，具有很高的白细胞数目。白细胞计数超过1000/mm 3时建议考虑一些低度炎性疾病，如SLE、风湿热、慢性痛风以及硬皮病，这些疾病具有相对较低的炎性细胞计数。RA的白细胞计数通常达到 2000一75,000/mm 3，超过1601000/mm 3的滑液应该怀疑感染的存在。类风湿关节炎、痛风性关节炎和赖特综合征、晶体诱导关节炎的白细胞计数有时可以达到100,000/mm 3以上。

      

31-4.jpg

   

      2.湿准备(wet preparation)   

      滑液检查中最重要的一步就是要马上取一滴关节液涂片进行关节液的镜下检查。通常检查非离心的关节液。但是离心后将沉淀物用清亮液体稀释后检查，有助于发现一些少见的晶体和细胞。这些检查必须用超净玻片，同一玻片还可以干燥后做革兰染色。   

      3.常规光镜检查   

      取一滴关节液首先进行常规的光镜检查。对可见的白细胞和红细胞进行计数，软骨或者滑膜片段中可能含有晶体。如果有足够的关节液，还可以离心后固定、染色。一些白细胞中含有闪亮的、圆的细胞内含物可能是扩展的巨噬体或者是脂质滴，这些具有包含体的细胞，称之为类风湿细胞(ragocyte)，首先在RA中被发现，后来发现在其他的炎性关节病的滑液中也存在。镰刀样红细胞可能提示镰刀样细胞贫血症或者细胞碎片，镰刀样红细胞可能被吞噬而引起炎症，不能因为关节液中有镰刀样细胞就确定是由于镰刀样细胞疾病引起。   

      在关节滑液中可以见到许多纤维样物质，一些纤维可能是纤维素，也可能是来自滑膜或者软骨片段的胶原。在关节置换后的关节积液中可能发现暗色的、不规则形状的纤维素或者多聚体片段。软骨片段在光镜下呈黄色或者土黄色。   

      大量的胞外脂滴存在于创伤性关节炎、各种类型的炎性关节积液，包括其他一些原因未明的关节积液和胰腺脂肪坏死液中。创伤情况下，脂质可能来自滑膜或者骨髓腔。如果骨折累及关节可能会发现针状骨质，这些针状物容易吸附在载玻片上。   

       无定型的球状或者不规则形状的物质，通常不具有折光性，可能是淀粉样物质，通常见于原发性淀粉样变、多发性骨髓瘤和W alden-strom巨球蛋白血病和慢性肾功能衰竭进行透析治疗的患者。这种物质往往在染色后显示为粉红色或者红色，在偏振光显微镜下可以是苹果绿色。关节中或者滑囊中还可以见到其他的闪亮球形或者硬币样物。碳酸样结晶或者其他含钙结晶可能被茜素红(alizarin red S)染成红色。对于晶体的检查必须仔细准备并且经常过滤染液，以避免假像发生。   

       在普通光镜下还可以见到二水焦磷酸盐(calcium pyrophosphate dehydrate，CPPD)、尿酸盐(monosodium urate monohydrate, MSUM )或者磷酸钙结晶。尿酸盐结晶通常呈圆棒样或针状，长约2 -- 20pmo磷酸盐结晶可能为粗细不等的棒状，但很少像尿酸盐结晶那么长，在普通的光学显微镜下很容易见到。草酸盐结晶可能是肾功能衰竭的并发症，呈多形性或者呈双金字塔状，以上晶体可以进一步经代偿的偏振光显微镜检查后进行分类。(表31一5)   

       4.代偿的偏振光显微镜   

       在偏振光显微镜中，一般的白炽光是光源发光经过偏振光镜光栅(polarizer)后，来自一个平面。当加人另外一个光栅，并与第一光栅成90度放置时，所有光都被阻挡，显微镜下视野会偏暗。如果有晶体物质放置在两个光栅之间的光学通路上，光会发生折射，形成快和慢的射线;与白炽光成不同的角度，这两个新的光学平面相互垂直，但是每一条都不会与以前的光束相平行。一些光束通过第二光栅(现在命名为分析器)时，就会在以前的暗视野中清晰的见到晶体。所有折光性物质都普遍存在这种现象。   

      在临床应用中，不同的折光性物质可以通过在第一光栅和标本之间放置另外一种折光性物质(补偿器)后光学性质的改变来进行区分。通常应用的补偿器是一块红板，可以去除背景中的绿色，产生一种玫瑰色背景。如果通过折光性物质的慢光束与补偿器之间相互平行，如尿酸盐或者焦磷酸盐会产生兰色光。如果同一晶体旋转90度，这样快光束会平行于补偿器的慢光束，消减后产生黄色光。

      

31-5.jpg

      利用代偿的偏振光显微镜可以将CPPD晶体和尿酸盐鉴别开来，因为在尿酸单盐晶体快光束在其长轴，当晶体与补偿器的慢光束平行时会产生黄色光。这种现象被命名为阴性光学征或者阴性延伸。CPPD晶体在其长轴方向上拥有慢光束，这样，当与补偿器的慢振动相平行时它们成兰色光(阳性延伸)。   

      在偏振光显微镜下，还可以在关节液中见到许多其他的折光性物质。结晶状激素制剂有时会被细胞吞噬并在关节内注射几个小时后引起一过性炎症。激素晶体可以表现为阳性或者阴性的折光性棒状，与尿酸盐或者 CPPD晶体的形状及大小类似，有时呈颗粒状，有时表现为不规则碎屑。

      在慢性关节积液中有时可以见到胆固醇结晶，尤其在类风湿关节炎中，这些晶体通常呈盘状，其中一角有一切迹，大小超过细胞，但是在胆固醇一雷登积液中的晶体也可以呈针状，伴阴性延伸。一些脂质滴看起来象阳性折光性马耳它式十字交叉物，.这在某些情况下可能是炎性的。   

      在关节液或者组织中的磷酸氢钙晶体成明亮的折光性。碳酸盐晶体结块偶尔有一些双折射。在嗜酸性粒细胞中偶尔可以见到针状的夏科一雷登样结晶。   

      其他许多不规则的折光性物质可能是假像，如载玻片或者盖玻片上的玻璃片段。胶皮手套上的粉末也可以呈折光性或者呈马耳它式的十字交叉外观。随着滑液放置时间延长，可以形成针状或者不规则的晶体，所以滑液检查应该立即进行。错误使用EDTA、草酸盐、肝素锉等抗凝剂可能诱导晶体产生，白细胞可以在体外吞噬这些晶体。   

      可以将偏振光滤片插人普通光学显微镜中，一个滤片放在光源和聚光镜之间，另外一个放在物体和目镜之间，使滤片旋转直到产生暗色视野，这样会产生白色的双折射，较光学显微镜下容易发现晶体，但是无法区分是阳性还是阴性的双折射。   

      晶体的确切诊断需要进行X线晶体衍射分析，但是这对晶体量的需要较大。尿酸酶消化尿酸盐，而对其他晶体不起作用。好在很少真正有需要用尿酸酶来消化。尿酸盐和 CPPD晶体有时非常小而且少，需要用电镜检测。尿酸盐晶体在普通电镜下观察即可，仅少量有典型的缺口，但是CPPD晶体却不然。碳酸盐晶体仅在电镜下可见。电子衍射或者电子探针的元素分析可以找到碳酸盐晶体或者其他磷酸钙颗粒。   

      滑液中含有很多类型的晶体及类似特殊物质，其中MSUM和CPPD晶体具有致病作用，其他的如胆固醇、脂质颗粒和碱性磷酸钙(BCP)，意义尚不明确。事实上，当滑液中存在MSUM和CPPD晶体，必须同时具有很高的多形核白细胞计数才能明确诊断痛风和假性痛风。这是风湿病学领域少数的几个可以改变临床诊治的化验之一，因此准确的识别 MSUM和CPPD是非常重要的。但是，常规进行的偏振光显微镜对于CPPD和MSUM的诊断确切吗?答案是否定的。在过去的综述和书籍中，作者往往强调应用偏振光显微镜可以简单、容易地识别两种晶体，但是事实并非如此。一些质量控制实验的测试表明，晶体识别在不同实验室之间的可靠性很差。将含有各种晶体的滑液标本送到不同的实验室检测，结果包括了各种类型的错误:假阴性、假阳性和错误分类。很明显，偏振光显微镜下晶体识别计数缺乏一定的敏感性和特异性。   

      缺乏敏感性的原因大都因为晶体过小或者过于分散(浓度过低)，不能在偏振光显微镜下发现。Gordon等人在滑液中加人不同浓度的晶体物质，发现显微镜检人员的晶体识别浓度阂值为10一100tcg/ml，而经纯化实验处理后，浓度阑值可以降低到2 ~ 3pg/mlo Dieppe发现，CPPD晶体长度在0.4一20pm之间，大多数晶体长度在光学显微镜识别闭值1 p.m以下，这是假阴性的原因。假阳性的原因是对MSUM和CPPD晶体的错误分类造成的，因此这是技术和经验问题。特异性低也是经验和熟练程度的问题。CPPD 比 MSUM 的问题多是因为CPPD的折光性很弱，在非偏振光显微镜下根据其形态进行鉴别较利用其折光特性进行检测可能更好一些。   

      敏感度的提高只能通过应用更复杂的技术，例如，滑液晶体的纯化和使用分析电镜，但是不实用。应该明确一个概念，滑液中的晶体不是“有或无”的，而是存在一个检测阂值。事实上，痛风和假性痛风的发作不可能由于体积和浓度都很小的晶体诱发，但是却可以引起滑膜炎的急性发作。因此，风湿科医生即使从一个有经验的操作者那里得到滑液分析偏振光显微镜检测的阴性报告，也不要排除滑液中存在小量或者体积较小的MSUM和CPPD晶体的可能。特异性的提高主要涉及经验、技术、设备和熟练程度。实验室可以通过更新实验设备、培训镜检人员来提高晶体识别的特异性。   

       1993年，阿姆斯特丹举行的EULAR会议上，风湿科医生一致呼吁改变常规偏振光显微镜对CPPD和MSUM晶体识别质量不佳的现状，EULAR拨出专项基金用于培训、制定规则和建立滑液晶体识别的质量控制方案。目前，已经有相关的手册发表并登录在EULAR的网站上并完成了一些培训，包括1997年维也纳举行的EULAR会议和美国Ralph Schmacher等人开办的类似培训课程。目前Dieppe等人正在Bristol筹建质控实验室，制定更具体的实践规则并开展培训计划。   

       5.滑液涂片染色   

       像外周血涂片一样，1到2滴滑液可以用肝素或者EDTA抗凝后进行涂片。如果白细胞数目多于2500/mm 3，涂片的效果就会很好。如果细胞计数较低，可以通过离心后将沉淀用上清液重新悬浮后再行涂片，效果会更好。   

       瑞氏染色是最有用的染色，在湿准备的情况下，可以通过体外活体染色显示细胞学特征。应该首先在低倍镜下寻找是否存在狼疮细胞、滑膜或者软骨片段，要注意寻找特异性的改变如痛风石等。血色病中可以见到软骨片段和含有金属颗粒的软骨细胞。褐黄病中可以见到褐色碎屑或者胞浆颗粒。涂片检查也可以见到骨髓中的骨针状物和脂肪等其他髓腔成分。   

       然后，要在油镜下仔细检查涂片。油镜下，细胞可以清晰的分为多形核白细胞、单核细胞、小淋巴细胞和大的单核细胞。RA滑液中存在转化的淋巴细胞，而急性痛风或者假性痛风中却没有，但是对大单核细胞的分类比较困难。在人HTLV-1相关的关节炎中，可以检测到不典型的淋巴细胞，表现核凝聚。体积较大的细胞(15-- 25pm)，胞核占据大部分胞浆，可能是转化淋巴细胞或者淋巴细胞前体。合成期滑膜衬里层细胞直径20一40p.m，核较大，位置偏离中心，体积占据胞浆一半左右。衬里层滑膜细胞与淋巴细胞核仁都较为突出。   

       关节液中的单核细胞可以用单克隆的抗体进行分类，这可能在诊断上有帮助。PMN的比例在区分疾病上是有帮助的。非炎性关节积液中，高比例的PMN计数应该考虑是否存在急性发作的晶体相关疾病，或者低度的炎性疾病。在炎性关节积液中，低PMN计数可以在早期RA, SLE、风湿热、硬皮病、真菌或者其他的慢J胜感染中见到。研究表明，药物也可以引起滑液细胞数目改变，单独应用NSAID可以引起关节液淋巴细胞增多。在既有中性粒细胞渗出又伴有衬里层细胞增殖的疾病中，可以见到衬里层滑膜细胞和大的单核细胞，吞噬后成为PMN，这些细胞在反应性关节炎中是常见的，但不具备诊断意义。除了反应性关节炎和痛风性关节炎以外，典型的浆细胞并不常见，尤其在有丝分裂期的浆细胞更难以见到。RA中可以见到巨噬细胞，其他疾病可能需要甲苯胺蓝染色或者其他特殊染色。在色素绒毛多结节滑膜炎与网状组织细胞增多症中可以检测到多核细胞，但是也可以在类风湿关节炎、骨关节炎或者其他疾病中检测到。巨噬细胞含有的暗紫色包含体可能是细胞碎屑，也可能是碳酸盐晶体和其他有机物的凝集块。在瑞氏染色中，偶尔可以在细胞中见到细菌。瑞氏或者革兰染色的涂片里也可以见到尿酸盐或者CPPD结晶。   

      在细胞计数时较少见到嗜酸性细胞，但是在用气体或者其他对照物进行关节造影后、血管性水肿以及胰腺疾病、肿瘤、放疗后、RA和嗜酸细胞增多症可以见到，在其他积液中例如感染性关节疾病、莱姆病、风湿热中只能偶尔见到。有时通过瑞氏染色、Papanicolaou染色或者免疫组化中偶尔能发现。嗜酸性细胞性滑膜炎往往伴有滑液IgE水平升高。   

      滑液涂片可以进行革兰染色。如果革兰染色没有见到细菌，不能排除感染性关节炎存在的可能。结核杆菌需要进行培养或者滑膜活检来确定。Whipple病中可以见到巨噬细胞内有酸性Schiff染色沉积。普鲁蓝染色可以在色素绒毛结节性滑膜炎或者血色病的滑膜细胞中检测到金属颗粒。(表31一6)

31-6.jpg

   三、特殊检查

      1.蛋白多糖(proteoglyean)

      可以检测透明质酸或者来自软骨的葡萄糖胺的含量，但是二者与临床表现并无肯定的相关性。骨关节炎的临床实验研究中，硫酸软骨素的检测最为有用，在前交叉韧带断裂后明显升高。

      2.糖   

      关节液中的葡萄糖检测应该同时与禁食后的血糖检查来进行对比，正常情况下滑液中的糖浓度略低于血糖。餐后血糖以及滑液中糖量的平衡是较缓慢的过程，因此，禁食后的水平最可靠。关节积液的糖量检测应放在氟化管中使滑液白细胞体外糖代谢终止。滑液含糖量的减低常提示感染存在。大多数RA的关节积液的葡萄糖水平低于血糖的一半，另有一些RA的滑液中葡萄糖含量比关节感染还要低。   

      3.补体   

      在去除蛋白的影响后，将滑液补体与血清中的补体水平进行比较才有价值。正常情况下，滑液中的补体含量约为血清含量的1/3-1/2。关节液或者血液马上离心，上清储存于一70℃冰箱中，准备全血和滑液的补体检测。在RA，血清补体通常正常，滑液中的水平低于30%。如果能够排除化脓性关节炎和晶体沉积性关节炎，滑液补体水平的明显减低高度提示血清阴性类风湿关节炎。SLE与肝炎中，血清和滑液的补体水平都降低。在感染性关节炎、痛风和反应性关节炎的滑液中补体水平升高，但是这主要是血清中补体水平升高的结果。补体C3和C4的水平可以通过免疫扩散来检测，用滑液中的球蛋白校正后，可以替代滑液中补体CH50测定。检测活性补体片段如C5a可能更有意义。在正常或者非炎性积液中，补体水平可能较低，因为这种情况下很少有补体或者其他蛋白释放进人关节间隙。   

      4.培养   

      怀疑有关节感染存在时应该马上进行滑液的细菌培养，许多实验室在关节穿刺抽液后马上种板，而不要在实验室以外操作;如果要培养需要复杂营养的微生物，需要获得相应实验室的帮助。   

      5.血清学检测   

      在滑液中可以检测抗核抗体、类风湿因子、免疫球蛋白和其他参与免疫反应的介质。但是，这些化验到目前为止，对临床研究还未产生多大意义。有时血清中RF或者抗核抗体阴性，但是在滑液中可能为阳性。目前尚不清楚关节液中以上阳性结果的意义。滑液中RF的检测也可以存在假阳性。免疫复合物可以用很多方法来检测，但是临床意义不大明确。   

      6.pH以及其他化学值   

      正常滑液的pH约为7.4，在炎性关节积液中轻度降低。这与白细胞增多有关，也与滑液的体积有关，类风湿关节炎相对贫血是一个重要因素。总蛋白在正常情况下平均为1.7g/d1,在炎性关节炎中升高。但是，蛋白水平所具有的临床诊断意义目前尚不十分明确。在正常关节液中，通常没有纤维蛋白原及其产物，因此正常的滑液是不会凝结的。在多发性骨髓瘤继发的淀粉样变的关节病变中可以检测到本一周蛋白轻链。   

      7.细胞因子   

      在关节液中检测到各种细胞因子及其抑制因子，以及其他的炎性介质。部分细胞因子的监测对临床有很大帮助。可溶性的IL-2受体含量可能与RA的病情相平行。   

      应用流式细胞仪可以分离滑液中的单核细胞，并且研究它们的细胞因子产物。研究表明，在活动性的RA中，T淋巴细胞产生的IFN-y增高。   

       8.气相色谱分析   

      滑液的气相色谱分析可以在培养阴性的感染性关节液中发现细菌产物的存在。在非球菌的感染性关节炎中，乳酸含量增加;在化脓性关节炎中，琉拍酸含量增加，并且可以持续到治疗以后，但是二者都不能独立作为感染存在的依据，只能作为辅助检查的手段，作为早期诊断的一种补充。   

      9. PCR反应   

      反向免疫电泳可以发现滑液中的蛋白或者其他的抗原。分子探针可以检测滑液或者滑膜组织中越来越多微生物的DNA或者RNA序列。PCR方法可以在反应性关节炎的关节液中检测沙眼衣原体。尽管这被认为可能是代谢形式发生改变的衣原体的局部人侵所致，其所提示的意义目前尚不清楚。尽管并不常见，但是在RA,OA或正常的关节中都可以检测到衣原体核酸。在临床不典型的Whipple病，对抗生素反应不好的情况下，可以通过PCR方法检测到Tropheryma Whippel II。   

      淋巴细胞转化实验也可以用来检测关节内的细胞免疫反应。进一步可以应用ELISA检测关节内的抗原与抗体水平，关节液的抗原与抗体水平要高于血清水平。这些研究可以帮助人们快速而准确的分析难以鉴别的感染性关节炎，例如淋球菌和分支杆菌关节炎。