一、ANCA的检测技术   

       1.间接免疫灸光法   

      (1)间接免疫荧光(indirect immunofluo-rescence, IIF)法:IIF法是最先应用，目前仍最常用、经典的ANCA检测方法。应用酒精固定的正常人中性粒细胞可产生两种荧光形态:在胞浆内呈粗大颗粒状、不均匀分布者称为胞浆型ANCA(cANCA)(彩图22一1),荧光沿细胞核周围呈线条状分布者称为环核型ANCA(pANCA)彩图22一2)，而在胞浆分布，但呈均匀细颗粒状，有时核周重染则称为非典型性ANCA(aANCA)(彩图22一3)。进行 IIF法检查时应注意如下几个问题:① 根据1988年哥本哈根第一届 ANCA国际研讨会所制定的方法，应选用正常健康人肝素抗凝血分离全体白细胞。其中除ANCA的靶细胞中性粒细胞和单核细胞外，还应包括淋巴细胞和嗜酸性粒细胞，后两者是非常重要的内参照物。淋巴细胞可用来判断自身抗体是否为中性粒细胞和单核细胞所特异的，从而帮助鉴别pANCA和抗核抗体。pANCA仅识别中性粒细胞和单核细胞，而ANA则同时还识别淋巴细胞的细胞核。嗜酸性粒细胞有两种用途:其一，帮助判断ANCA的荧光强度，以嗜酸性粒细胞的天然荧光为基础并与其相比较，可确定ANCA荧光亮度的分级。其二，嗜酸性粒细胞天然荧光还可以帮助判断制片是否成功，细胞形态是否满意。嗜酸性粒细胞胞浆内有粗大均匀一致的颗粒，在紫外光激发下可产生暗黄绿色的均匀一致自然荧光。典型的cANCA为胞浆不均匀着色，在细胞核核叶之间有重染，有时形成小团块或粗大颗粒状(彩图22一1)。故应注意区分，切忌将二者棍淆。② 分离的白细胞应均匀一致呈单层涂布于玻片上，不可有成堆或重叠的白细胞。标准的方法是选用细胞离心机(cytospin)将白细胞甩在玻片上呈单层均匀分布，并可使细胞浆及细胞核平展充分。③目前最为常用的固定剂是预冷的纯酒精，纯酒精和丙酮一样，属于非交联性固定剂，可增加细胞膜结构的通透性，ANCA特异性靶抗原物质可从中性粒细胞胞浆的嗜天青颗粒中释放出来。这样，带正电荷的蛋白质如髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)则可穿透膜结构游离出来而吸附在带负电荷的细胞核周围，致使抗MPO自身抗体形成环核型的pANCA;而cANCA的靶抗原蛋白酶3 (proteinase 3 , PR3)属弱阳性离子或中性蛋白，不会吸附于细胞核周围，因此就形成胞浆型的。ANCA。如应用交联性固定剂如福尔马林或多聚甲醛，则ANCA均表现为。ANCA，而无pANCA。这是由于细胞胞浆内许多ANCA特异性靶抗原不能从嗜天青颗粒中释放出来，带正电荷的MPO等蛋白质也被固定在嗜天青颗粒内而不能穿透膜结构，因此不能区别不同的ANCA类型。此外，交联性固定剂可使部分ANCA的特异性抗原失去与自身抗体相结合的能力，即丧失了抗原决定簇。基于上述两种原因，目前国际上并不主张应用交联性固定剂。但应注意的是，甲醛固定能破坏核抗原，可阻止与ANA的结合，因此在鉴别ANCA和ANA时有一定应用价值。④ 每次检测均应有阴性对照、cANCA和pANCA的阳性对照。有条件者应在每张玻片上加一阴性对照(每张玻片上至少有两孔白细胞膜方可)。⑤ 判断 IIF结果时，应由两位受过培训的医师或技师在双盲条件下读片以除外主观因素。读片时应在低倍镜下判断是否阳性，在高倍镜下观察形态并判断cANCA或pANCA.  

      (2)ANCA和ANA的鉴别:由于许多自身免疫病患者血清中存在ANA，应用IIF法检测ANCA时，pANCA和ANA很难区分，应引起特别注意。现ANA检测多采用人喉癌上皮细胞(HEp-2细胞)作为抗原基质细胞。早在50年代末ANA检测初期，曾采用人白细胞涂片作为抗原基质细胞的IIF法检测ANA。应用酒精固定中性粒细胞抗原片检测ANCA时，如被检血清中存在ANA，特别是荧光染色表现为均质型(homogeneous pattern)的ANA，易在中性粒细胞核上表现为核周型或核周型/均质型荧光染色，很难同pANCA鉴别。如同一份血清pANCA阳性同时伴有均质型ANA阳性，则鉴别更为困难。有学者提出可利用基质细胞片中存在的少量的淋巴细胞来除外ANA，但如ANA和ANCA同时存在则无能为力。因此，ANA阳性，特别是强阳性者，单独应用IT法检测ANCA是不可取的，其结果也是不可靠的。   

      为避免ANA的干扰及提高区分不同AN-CA荧光类型的能力，目前许多实验室采用多种抗原基质细胞(如乙醇固定抗原片/甲醛固定抗原片/IEp-2细胞抗原片)联合检测，通过被检血清在不同基质细胞上的反应，综合判断检测结果。如乙醇固定抗原片检测表现为pAN-CA，再用甲醛固定片检测，真正的pANCA则转换为。ANCA, ANA假阳性则表现为阴性。这种荧光染色类型的转变现象有助于pANCA或aANCA与ANA的鉴别。   

      2.固相放免和酶联免疫吸附法   

      1987年Savage等首先推出了应用放免分析(radioimmunoassay, RIA)的方法检测AN-CA，其抗原是应用超声粉碎方法获得的中性粒细胞的酸性浸出物，理论上它应包含所有中性粒细胞的胞浆成分，故又称之为总抗原。由于长期应用放射性同位素对操作人员身体有害，且放射性同位素存在着半衰期的间题，故现在一般采用酶联免疫吸附法(ELISA)。应用总抗原的ELISA方法，理论上应该能检测到任何一种ANCA抗原，但实际上并不然，原因如下:①中性粒细胞胞浆内成分很多，每种蛋白质的含量不一，含量多者相对易于检测到。如MPO是胞浆内的主要蛋白成分，所以易于包被到酶联板上。②不同的蛋白质在同一种包被液的条件下(如常用的0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)，结合到ELISA板上的能力也不同，有的蛋白甚至不能结合。不同厂家的酶标板其结合能力有时也有一定差别。③蛋白质被消化或降解，由于中性粒细胞胞浆内富含各种蛋白水解酶，可能相互作用。例如，在中性pH值的条件下，PR3和人白细胞弹力蛋白酶(human leuko-cyte elastase, HLE)可以迅速降解杀菌/通透性增高蛋白(bacteriocidal巾ermeability-increasingprotein, BPI)。与肾脏小血管炎关系密切的二种主要抗原MPO和PR3在适宜的抗原浓度下均可以包被到ELISA板上，故总抗原ELISA法仍有一定应用价值，但这种方法无法得知抗原的特异性，临床应用已经日益减少。   

      随着ANCA特异性靶抗原逐一被发现并得以纯化，抗原特异性ELISA检测方法近年来得以迅速推广，由于不同的ANCA及其不同的抗原系统往往和临床上不同的疾病或临床综合征相关，故抗原特异性ELISA显示出了它们独特的优点。它们更敏感、更特异，可以直接用于协助临床相关疾病的诊断和分类，在指导治疗、判断病情复发上意义重大。一些重要的抗原特异性ELISA已经商品化，在发达国家已列为常规检查项目。抗原特异性ELISA多用高纯度的抗原直接包被ELISA板。但检测PR3抗体也可以应用夹心法ELISA，该方法以抗PR3单克隆抗体包被到ELISA板上并用其捕捉PR3分子作为抗原，目前认为夹心法ELISA较直接包被的抗原特异性 ELISA更敏感，因为 PR3的抗原决定簇是立体构型，PR3直接结合到ELISA板上会丧失部分抗原决定簇。因此目前国际上更提倡使用夹心法ELISA检测抗PR3抗体。   

      3.其他检测技术   

      临床常规检测ANCA一般选用IIF法作为筛选试验(screening test)，抗原特异性ELISA作为确证试验(confirmation test)，其他还有免疫印迹法(immunoblot analysis, IB)、免疫沉淀法(radioimmuno-precipitation assay,RIP)、斑点杂交(印迹)法(dot blotting)、流式细胞术(flow cytometery, FCM)等均可以被用于检测ANCA。但临床应用并不广泛，其中部分项目主要用于科研。

   二、ANCA的抗体类型和亚型   

       I . ANCA的抗体类型   

      目前临床检测的ANCA主要为IgG型自身抗体，但其他类型的ANCA也有报道。如应用IIF法可以在MPA患者的血清中检测到IgM-ANCA，而且它主要见于合并肺部出血的小血管炎。同样应用IIF法，在20世纪90年代初，有个别报道在过敏性紫瘫病人的血清中检测到IgA型ANCA，但未能得到他人的证实。1995年，Zhao等在囊性纤维化病人血清中则应用 IIF法和抗原特异性ELISA法明确检测到IgA型ANCA。

      由于临床上常规并不检测IgM型和IgA型ANCA，这些类型的ANCA的发生率有可能被低估。   

      2. IgG-ANCA的亚型   

      正常人IgG可以分为4种亚型，即IgGl,IgG2, IgG3和IgG4。不同亚型的理化性质和生物学功能并不完全一致。如IgG3的半衰期只有7天，而其他亚型为20一21天;IgGI和IgG3具有较强的固定补体和结合吞噬细胞的能力。IgG型ANCA也可以分为4种不同的亚型，在疾病的活动期4种亚型的阳性率均较高，但在缓解期IgG3阴转的百分率最大，因此，目前人们认为ANCA的IgG3亚型与小血管炎的临床活动性关系最为密切，而IgG4则主要与长期抗原刺激有关，可以维持长期阳性。因此，临床上可以见到部分ANCA相关小血管炎患者经过免疫抑制治疗后临床完全缓解，但血清中ANCA虽然滴度下降但并未转为阴性。

   三、ANCA的特异性靶抗原   

      自ANCA被发现可作为诊断部分原发性小血管炎特异性的血清学诊断工具以后，80年代末以来ANCA特异性靶抗原就逐渐被一一发现。到目前为止，已有多种中性粒细胞胞浆成分被证实为ANCA的抗原，如表22一1所示，这里着重介绍几种较重要的ANCA抗原。

22-1.jpg

      1.蛋白酶3   

      蛋白酶3 ( proteinase 3, PR3)于1989年被证实为。ANCA的靶抗原。PR3是中性粒细胞嗜天青颗粒中被发现的第三个中性丝氨酸蛋白酶，并因此得名。前二个分别为人白细胞弹力蛋白酶(human leukocyte elastase, HLE)和组织蛋白酶 G ( cathepsin G) o PR3是 1978年由Baggiolini等人首先报道的26 . 8kD的糖蛋白，由228个氨基酸组成，其氨基酸序列和1989年由Bories等报道的促髓素(myeloblastin) , 1980年Campanelli等报道的中性粒细胞抗生素-p26b蛋白是完全一致的。故目前认为这三种蛋白描述的是同一成分。PR3是一个等电点在8.0左右的蛋白酶，其蛋白酶的活性可以由数个不同的底物来检测o   al一抗胰蛋白酶(。:-AT) ,+2一巨球蛋白和elafin是PR3生理条件下的酶抑制剂。在聚丙酞胺电泳上，PR3表现为29kD左右的三条条带。PR3存在于中性粒细胞和单核细胞的嗜天青颗粒(初级颗粒,a颗粒)。炎症反应或中性粒细胞受到炎性因子刺激时，颗粒的膜结构就会和细胞膜相融合并导致脱颗粒反应。PR3像弹力蛋白酶一样可以消化、降解不溶于水的弹力蛋白。在轻度偏酸的条件下，PR3比弹力蛋白的蛋白水解酶活性更强。PR3还可以消化降解许多不同的细胞外基质，如纤粘连蛋白(fibronectin)、胶原N (colla-gen N ) ,层粘连蛋白(laminin )，但它不能降解间质的工型胶原、班型胶原。1988年Kao等在动物试验中证实吸人 PR3可以导致仓鼠出现严重的肺气肿，提示其具有重要的病理生理功能。此外，PR3可以促进中性粒细胞迁移通过基底膜，PR3还可以消化、降解某些吞噬到中性粒细胞内的微生物。PR3广泛的生理功能显示它具有重要的防御功能和潜在的病理生理作用。   

      抗PR3抗体相对特异性较高，主要用于诊断WG，患者血清中的抗 PR3抗体可以识别PR3分子上不止一个抗原决定簇。免疫印迹方法证实，其抗原决定簇具有三维立体构象，应用还原剂打开二硫键以后则可以使其丧失抗原决定簇而不能与抗PR3抗体结合。  

      2.髓过权化物酶   

      Falk和Jennett。在1988年发现髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)为pANCA的主要靶抗原，但并非所有pANCA阳性的血清都识别MPO。同样，有一少部分抗MPO抗体阳性的血清也可以产生cANCA. MPO在中性粒细胞嗜天青颗粒中含量最为丰富，可以占到中性粒细胞干重的5%0 MPO含有亚铁血红素，呈绿色。MPO在酸性条件下不稳定，可以丧失其酶活性和MPO-ANCA的抗原决定簇。MPO是带正电荷的糖蛋白，等电点李11，其分子量在133-155kDa MPO分子结构中包含二条重链和二条轻链，重链约为57kD，而轻链约为16-18kDo MPO可以催化过氧化氢(玩q)和卤素(Cl-)反应产生次氯酸，在中性粒细胞的氧爆炸或产生超氧阴离子的过程中具有重要作用，并因此可作为抗生素杀死吞噬的微生物。MPO是骨髓造血过程中髓系分化的一个极为有价值的标记物，而且在诊断髓系细胞(An粒细胞、单核细胞)白血病中具有重要意义。   

      抗MPO抗体可见于MPA, CSS和少免疫沉积型NCGN。同抗PR3抗体一样，患者的抗MPO抗体也可以识别 MPO分子上不同的抗原决定簇，在高温、酸性以及应用还原剂等条件下可丧失抗原决定簇。   

       3.杀菌/通透性增商蛋白   

       杀菌/通透性增高蛋白(bactericidal布erme-ability-increasing protein, BPI)是 1995年由Zha。等人发现的另一重要ANCA抗原。BPI是中性粒细胞嗜天青颗粒内的55kD的具有杀菌活性的蛋白质，是中性粒细胞内最为重要的抗革兰阴性菌的内源性抗生素。它可以杀灭多种革兰阴性细菌，如绿脓杆菌。除此之外，BPI还可 以 中和 血 清 中游 离 的 脂 多 糖(lipopolysaccharide, LPS )，具有明确的抗感染、纠正内毒素血症的作用。BPI由两部分组成，其氨基端具有全部杀菌功能，是很强的带正电荷的碱性蛋白，而梭基端则镶嵌在嗜天青颗粒的膜上，具有免疫调理功能。BPI分子由487个氨基酸构成，从第240一245个氨基酸是潜在的弹力蛋白酶的消化位点。最近的研究已经证实，在中性pH值的条件下，BPI可以迅速被PR3和人白细胞弹力蛋白酶(HLE)降解，这可能是BPI不易被常规的IIF法和总抗原ELISA法检测到的原因。   

      BPI是IIF法中不典型ANCA的靶抗原之一。抗BPI抗体的特异性不高，可以见于原发性小血管炎、炎性肠病、慢性炎症性肺部疾病(特别是长期痰中绿脓杆菌阳性的患者)如囊性纤维化(cystic fibrosis)和弥漫性全小支气管炎(diffuse panbronchiolitis,DPB)等。抗BPI抗体既可以为IgG型，也可以为IgA型，提示其可能与粘膜免疫相关。   

      BPI的杀菌和中和内毒素功能可以被多克隆兔抗人BPI的IgG阻断，提示该多克隆抗体封闭了BPI的氨基端，但近年的研究发现患者的抗BPI抗体并不能抑制 BPI的杀菌和中和内毒素的功能。通过重组的嵌合蛋白(chimericprotein)的研究发现，人抗BPI抗体所识别的抗原决定簇主要位于BPI分子的梭基端，进一步的研究证实患者的抗BPI抗体可以影响BPI分子的免疫调理功能。   

      4.中性丝氨酸蛋白酶家族的其他成员   

      中性丝氨酸蛋白酶家族，共有四个成员，即人白细胞弹力蛋白酶(FILE)、组织蛋白酶 G(cathepsin G), PR3和天青杀素(azurocidin) o这四个成员先后均被证明系 ANCA靶抗原。除PR3外，其余三个成员均非ANCA的主要抗原。由于这四个成员的氨基酸序列同源性很高，故被归为同一家族。除天青杀素外，其余三者均具有蛋白水解酶的活性，它们既具有相同的、也有各自特异的底物。三者均可消化、降解许多细胞外基质，在炎症的病理生理过程中很可能有重要意义。四个成员均具有杀菌、抑菌的能力，特别是天青杀素，在中性粒细胞内是仅次于BPI的抗革兰阴性细菌的内源性抗生素。四个成员的分子大小基本相同，在聚丙酞胺电泳上均表现为29kD左右的条带。   

      除抗PR3抗体以外，以另外三种蛋白为抗原的ANCA在 IIF法均表现为 pANCA或AANCA，其临床意义尚不明确，但近期在北京大学第一医院的研究发现，甲状腺功能亢进患者应用丙基硫氧哦吮(propylthiourcil, PTU)诱发的ANCA可以识别上述抗原。   

      5.其他少见ANCA抗原   

      在中性粒细胞嗜天青颗粒中，防御素(de-f ensins)和R-葡萄糖醛酸酶(R-glucoronidase)亦是ANCA特异性抗原。防御素是29一43个氨基酸组成的碱性多肤(带正电荷)，人中性粒细胞的防御素共有四种，其中前三种之间只有一个氨基酸的区别，防御素亦为中性粒细胞嗜天青颗粒中的主要蛋白成分(占总细胞重的5%--18%)。防御素也具有抗菌素的活性，可以杀灭细菌、真菌甚至病毒。在体外，防御素还具有其他生物特性，如细胞毒性(诱导DNA崩解)、化学趋化等。p一葡萄糖醛酸酶则是75kD的酸性水解酶。抗防御素抗体主要见于慢性高反应性盘尾丝虫病(chronic hyperreactive on-chocerciasis，一种热带的寄生虫感染性疾病)。   

      在特异性颗粒中，乳铁蛋白(lactoferrin )为ANCA的一个特异性抗原。乳铁蛋白是由692个氨基酸组成的单链铁结合蛋白，约78kD。人类的乳铁蛋白除存在于中性粒细胞外，还可以在乳汁、眼泪和唾液中发现。抗乳铁蛋白抗体可见于系统性红斑狼疮、药物诱发的ANCA阳性小血管炎等。而溶菌酶( lysozyme)在嗜天青颗粒和特异性颗粒中均存在，并由Schmitt于1993年首先报告为ANCA靶抗原，但其临床意义至今还不清楚。乳铁蛋白和溶菌酶均具有抑菌功能。   

       除颗粒成分外，中性粒细胞胞浆成分也可作为 ANCA抗原，如 a一烯醇酶( a-enolase )是48kD的胞浆抗原，催化酶(catalase)为57kD的胞浆抗原，两种胞浆抗原均可以被部分炎症性肠病患者血清中的ANCA所识别，但其临床意义尚不清楚。