一、凋亡相关基因的克隆   

        细胞凋亡研究的快速发展得益于凋亡相关基因的发现。1986年，Tsujimoto教授在美国工作期间，首次克隆了与B型淋巴瘤相关的基因Bcl-2。后来有人证明Bcl-2基因在细胞凋亡调节中起关键作用。大量的细胞凋亡基因的克隆及其相互关系的研究是从实验动物线虫(Caenorhabditis elegans)中开始的。线虫成熟个体总共有 1090个细胞，在其发育过程中，其中有131个细胞会发生凋亡。这些细胞的死亡是受基因严密调控的。有人分离了一些线虫突变体，这些突变体在发育过程中其本应凋亡的细胞不发生凋亡，从而导致了发育异常。袁钧英教授在哈佛医学院Horvitz教授实验室首先从线虫中克隆了凋亡相关基因，并发现Ced-3是caspase的一种类似物，Ced-4是一种新的凋亡调节蛋白。有意义的是，科学家发现Ced-9不仅是线虫凋亡抑制因子，同时也是哺乳动物细胞Bcl-2的同源类似物。这表明了细胞凋亡机制在进化过程中的保守性。线虫细胞凋亡的研究确立了细胞凋亡的基本框架。目前知道，线虫中的Ced-3(哺乳动物细胞caspase类似物)和Ced-4(哺乳动物细胞中APAF-1类似物)为凋亡促进因子。其他的多数基因如Ced-1, Ced-2 ,Ced-5 ,Ced-6 ,Ced-7和Ced-10则负责死亡细胞碎片的吞噬和清除。具体地讲，Ced-6编码一种称为ABC(ATP-binding cassette)的转运蛋白，参与细胞质膜物质转运。Ced-7参与吞噬细胞与凋亡细胞的相互作用过程中的相互识别。Ced-2,Ced-5和Ced-10可能与细胞迁移有关。Ced-5编码一种DOCK180 (downstream of CRK，一种原癌蛋白)蛋白，负责吞噬细胞表面的牵张，以包裹和吞噬凋亡细胞。不同吞噬相关基因如何协调起来参与吞噬过程的分子机制目前尚不清楚。   

      Ced系列基因相互作用，调节细胞凋亡过程。细胞凋亡的经典途径和凋亡基因相互作用的模式图如下(图8一1)：

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      可以说，线虫发育过程中细胞凋亡的研究为哺乳动物和人类细胞凋亡的研究奠定了基础。此后，科学家克隆了大量其他动物细胞凋亡相关基因，即线虫凋亡相关基因的类似物。当然，高等动物细胞凋亡调节机制更为复杂。   

      天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspases)是Ced-3在哺乳动物细胞中的同源类似物。这一组蛋白酶结构相关，主要存在于细胞胞质中。目前已克隆出16个同源基因，它们的共同特征之一是在细胞内以酶原的形式存在，约30～50kD，这些酶原由一个大亚基和小亚基结构域组成。在caspase激活酶链中，上游的Caspase 8, 9, 10与调控蛋白如FADD和/或Apaf等相互作用，形成复合体。很可能这些复合物的形成促使caspase自动催化裂解，在天冬氨酸残基后的肽键特异切断，形成活性分子。被激活的上游caspase能进一步激活下游的效应分子(effector enzymes)如Caspase 3、6、7等。并不是所有的caspase都参与细胞凋亡，如Caspase 4, 5, 11, 12, 13，很可能参与炎症反应。caspase被激活后能特异切割细胞内多种底物，这些特异性底物包括:①信号分子如MEKK1、p21活化的激酶2、焦点粘附激酶、Raf-1和Akt等。②细胞凋亡调控蛋白如Bcl-2、 Apaf-1和DNA酶(DFF, DNA片段化因子)抑制剂(ICAD)等。ICAD的切割导致有活性的DFF释放并转移至细胞核，切割DNA，形成核小体，这是凋亡细胞特有的DNA阶梯(DNA Ladder)片段形成的主要原因。③细胞周期调控蛋白如Rb(视网膜母细胞瘤蛋白，Retinoblastoma protein)、 Cyclin E等都能被切割。④结构分子如actin、 fodrin、gelsolin、lamin和细胞内重要的酶如DNA修复相关酶 PARP[多(ADP核酸糖)多聚酶，Poly (ADP-ribose) polymerase]等。   

      在凋亡过程中被caspase切割的模式图如图8一2 。Caspase-3酶原为32 kD分子，在凋亡过程中能被Caspase-9或自身切割成分子量为17kD和 12kD的小分子短肽。这两个短肽通过二硫键连在一起，具有蛋白酶活性，能切割多种在细胞中起重要作用的蛋白分子(见正文), PARP是一种 DNA结合蛋白，在DNA损伤修复中起关键作用。它能被Caspase-3切割，丧失DNA修复功能。

      

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二、Bcl-2家族蛋白和细胞内的凋亡抑制分子   

      Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡调节中起检测点(check-point)作用。线虫Egl -1和Ced-9基  因是Bcl-2及其家族蛋白在人类和其他哺乳动物细胞中的同源类似物。目前已克隆出了24个Bcl-2家族蛋白基因(图8一3)。这个家族中包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。抗凋亡蛋白包括Bcl-2及同源蛋白Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1、Al和病毒编码蛋白BHRF1、LMW5-HL、ORF-16、KS-Bcl-2、ElB-19k等，它们多数具有 BHl、BH2、BH3和BH4结构域，其中BH4是抑制凋亡蛋白分子特有的结构域。促凋亡蛋白包括两个亚家族，即Bax亚家族蛋白如Bax、Bak、Bok、Bik、Blk、Hrk、BNTP3等，含有BHl、BH2、BH3结构域和Bid亚家族如Bim、Bad、Bid、Egl-1等，仅含有BH3结构域。可见，BH3结构域为该家族所共有，并在促凋亡作用中起关键作用。最新的研究表明，人工合成的BH3短肽能诱导线粒体发生凋亡反应。

      

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     有关Bcl-2家族蛋白调节细胞凋亡的机制目前尚不清楚。有很多研究表明，促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白分子相互作用，从而调控线粒体凋亡相关物质如细胞色素C的释放和线粒体的功能。在凋亡因子刺激下，促凋亡蛋白分子以多种方式被激活，并转移到线粒体上，促进线粒体内外膜之间的凋亡相关物质(如细胞色素C)的释放。如Bid能被caspase-8切割，Bid被切割后的产物——tBid能转移到线粒体，与线粒体Bcl-2家族蛋白如 Bax/Bak相互作用，从而诱导细胞凋亡。再比如线粒体Bad能被磷酸化，并与Bcl-XL结合，从而可解除Bcl-XL抑制细胞凋亡的功能。Bax的表达受 p53转录调节，当DNA损伤诱导p53水平升高时能促使Bax蛋白的大量表达。   

       细胞内凋亡抑制因子(intracellular inhibitor of apoptosis, IAPs)是一类独立的抗凋亡蛋白家族，在进化上高度保守。神经细胞凋亡抑制蛋白(NAIP)是通过由严重脊柱肌肉萎缩的病人NAIP突变而发现的。这一家族中的另外四个成员分别是c-IAP-1, c-IAP-2 , x-IAP和survivin研究表明，IAPs主要通过抑制效应caspase活性来阻断细胞凋亡。

三、细胞凋亡的信号转导   

       细胞凋亡的信号转导途径(图8—4)可分为受体介导和和非受体介导的凋亡途径两种:   

      1.受体介导的细胞凋亡  

       肿瘤坏死因子配体(TNF)及其受体(TNFR)超家族的成员在免疫调节中起着关键作用，有些成员在神经系统或其他器官发育中也起着重要作用。目前已克隆的TNF配体有18个，包括TNF、FasL、TRAIL (TNF related apoptosis-inducing ligand)等。这些配体多为跨膜蛋白，其胞外区能被金属蛋白酶( metalloproteinase)切割，变成可溶性蛋白汾子。这些分子可形成三聚体或病毒样多聚体来发挥其生物学功效。FasL是一种分子量为40kD的二型跨膜蛋白，即N末端在胞浆，而有150氨基酸的C末端暴露在胞外。FasL与TNF超家族配基有20%～25%的氨基酸相同。FasL主要在眼睛前房室和睾丸中表达，并在CD8+Thl细胞、CD4+T细胞和一些NK细胞中被激活表达。它在细胞表面的存在时间很短，金属蛋白酶可将其细胞外面部分裂解，成为可溶的有功能分子。

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      TNF受体有27个，包括 Fas、TNFR I、DR-3 (TRAMP/wsl/APO-3)、DR-4、DR-5和DR-6。DR-4和DR-5是TRAIL的受体。这些受体包括胞外区、跨膜区和胞内区。在细胞外区域，TNFR家族成员有2～6个富含半胱氨酸的结构域。Fas/FasL的共晶体结构解析表明CRDs以线性排列方式伸出细胞表面，与配体亚基界面有明显接触，每个配体趋向于形成三聚体，配体的聚合促进了受体成簇，受体成簇导致了细胞内结构域的并置和外源信号传人细胞内。TNFR及其家族受体的胞内结构域中有一个约 70个氨基酸的同源区称为死亡结构域(death domains)。最初，形成三聚体的 TNFR和Fas等能通过其凋亡结构域与下游信号转导分子FADD (fas associating protein with deathdomain)相结合。FADD分子是C末端含死亡结构域的蛋白分子，它能通过其N端的死亡效应结构域(death effector domain)进一步选择性吸引Caspase-8和Caspase-10。Caspase-8和10具有双边结构，包括DED和caspase酶结构域，后者把 Fas凝聚和凋亡执行阶段联系起来。Caspase-8和10的前体和激活的Fas复合体结合导致了自我催化裂解和激活，这些酶的激活能够进而启动一个导致细胞程序化死亡的蛋白酶水解体系。TNFR家族成员蛋白还能通过与TRAF(TNF receptor-associated factor)结合激活NF-KappaB和JUN kinase信号途径。   

       2.非受体介导的细胞凋亡信号转导   

       细胞保持生理活性需要各种生存信号(surviving signals)。相邻细胞间信号和细胞外基质的丧失和变化，支持细胞生长的细胞因子等生长因子不足，多种病毒和多种临床化疗药物和放疗都能诱导细胞凋亡。多种化疗和放疗剂可直接引起细胞核DNA损伤，导致p53含量上升，p53水平的增加诱导促凋亡蛋白分子Bax增加和移位至线粒体外膜。这种移位的Bax能与线粒体上Bcl-2分子作用，促进线粒体细胞色素C释放和细胞凋亡的发生。p53还能诱导细胞周期依赖激活的抑制物P21产生，引起细胞周期停滞。如果 DNA损伤被修复，细胞周期停滞就能被解除，如果损伤不能被修复，则细胞开始凋亡。  

      线粒体在非受体介导的细胞凋亡中起着关键作用。目前知道，线粒体在细胞内不仅作为能量代谢(三羧酸循环和氧化磷酸化)的主要场所，还是细胞凋亡的调控中心。线粒体主要从以下三个相互关联的方面影响细胞凋亡：即电子传递和能量代谢的破坏、凋亡相关物质的释放和细胞内自由基产生的大量增加。这三个方面可能互为因果，即能量代谢的破坏可导致凋亡物质的释放，释放的凋亡物质如细胞色素 C可进一步导致呼吸链和能量代谢的破坏。在正常的生理条件下，细胞色素C在呼吸链上起电子传递的作用，一旦细胞色素C从线粒体释放至细胞浆中，不仅会引起线粒体呼吸链的破坏，导致ATP合成的大量下降，还会引起自由基产生的大量增加。细胞色素 C从线粒体内外膜间隙释放至胞浆中并激活细胞凋亡通路是细胞凋亡研究的一个里程碑式的发现。释放至胞质溶胶中的细胞色素C能与辅助因子Apaf-1结合(Ced-4类似物)并在ATP或dATP存在下促使其形成多聚体，这一多聚体进一步促使Caspase-9与其聚集，形成凋亡小体。这种凋亡小体促使Caspase-9前体转化为其活性形式并作用于效应caspase如Caspase-3，细胞便发生不可逆凋亡。最近的研究还表明，caspase被激活后能反过来作用于线粒体，正反馈调节细胞色素C的释放和自由基的大量产生。此外，在凋亡因子的刺激下，线粒体还释放细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor, AIF)和Nuclease G至胞质中，从而诱导不依赖caspase的细胞凋亡。有关细胞色素 C释放的分子机制是目前细胞凋亡研究领域的关键问题。有证据表明，促凋亡蛋白如Bax等能富聚到线粒体外膜上，形成大的通道，从而介导细胞色素C释放。也有人认为，Bcl-2、Bax、Bak能与线粒体膜孔蛋白VDAC和ANT结合，直接影响线粒体膜孔的开放和关闭，从而介导细胞色素C等凋亡相关物质的释放。   

      受体介导的与线粒体介导的细胞凋亡信号途径之间存在相互对话。受体激活的Caspase-8的下游底物之一是促凋亡蛋白Bid，被切割的Bid能更有效地转移到线粒体，并与Bax/Bak相互作用，诱导线粒体细胞色素C释放并激活线粒体介导的细胞凋亡途径。另一方面，有些凋亡因子能激活线粒体凋亡途径，同时也能诱导FasL/TRAIL表达，激活受体相关的信号通路。

      3.细胞介导的细胞凋亡免疫细胞杀伤   

      并不是所有的细胞死亡形式都是细胞自杀性行为。在有些情况下，一种细胞能杀死另一种细胞。在人类和哺乳动物免疫系统中存在T淋巴细胞，它能杀死被病毒感染的细胞和其他受损伤的细胞。杀伤性 T细胞通过细胞膜表面受体识别病毒感染的细胞，如有一种杀伤性T细胞可被穿孔素(Perforin)介导，大量释放丝氨酸蛋白酶Granzyme B等，切割细胞内多种蛋白和激活凋亡中起重要作用的caspases，从而诱导细胞凋亡。T淋巴细胞还通过氧爆发释放大量的自由基来诱导细胞凋亡。

四、凋亡细胞的清除   

      免疫系统每天要从体内清除超过108个凋亡细胞。淋巴器官、胸腺和骨髓在抗原重排和负向选择过程中有大量的细胞发生凋亡，而淋巴细胞和脊髓细胞生活周期也相对较短。因此，外周免疫系统是一个重要的凋亡细胞中心。在胸腺、骨髓、淋巴小泡等位点，由吞噬细胞快速和高效率地清除凋亡细胞。   

      在细胞凋亡早期，细胞表面膜上出现磷脂酰丝胺酸(PS).。PS通常在细胞质膜内表面，在凋亡过程中，由于转移酶功能减弱，或 lipid scramblase的激活，可引起 PS暴露。PS能被吞噬细胞受体识别，触发吞噬作用。从凋亡细胞中衍生的一些碎片可能由树状细胞或吞噬细胞呈递给淋巴细胞。细胞吞噬过程是一个受基因调控的过程。在C.elegans的14个凋亡基因中，至少有六个基因是与吞噬凋亡细胞相关的基因(见上)。多种细胞膜表面的受体参与了凋亡细胞的识别和吞噬过程。如整合素分子玻连蛋白(Vitronectin)受体αvβ3、αvβ5等、非整合素受体ABC1 (ATP-binding cassette transporter)和CD14等都参与这一过程。有关凋亡细胞的吞噬和消化过程目前尚不清楚。凋亡细胞碎片和被消化的核酸-蛋白复合体有可能作为自身免疫抗原，产生免疫反应，与自身免疫疾病的发生直接相关。此外，由凋亡细胞产生的被消化的蛋白分子短肽可通过树突状细胞(dendritic cells)呈递给淋巴细胞，刺激自身免疫反应。很显然，凋亡细胞的吞噬异常与多种自身免疫疾病直接相关。