合成肽疫苗具有常规疫苗不可比拟的优点，近年来得到广泛研究。本文介绍了预防性和治疗性丙型肝炎病毒（ hVC）合成肽疫苗的研制及效果。


　　近年来有关 hCV感染的研究进展很快，但主要体现在实验诊断技术的发展、抗病毒治疗的应用、发病机理的探讨和病理改变的观察等方面，而有关 hCV感染的保护性免疫和疫苗制备的研究进展则很慢。虽然 hCV检测技术的改进和提高已大大降低血液制品传播 hCV的危险性，但在高危人群中 hCV感染仍严重，甚至不少感染者并没有明显的输血史；由于 hCV基因序列的高度变异性，导致 hCV准种(quasispecies)的存在和免疫逃避现象，从而使 hCV得以逃脱宿主免疫机制作用，造成 hCV感染慢性化，因此，研究预防/治疗性疫苗，以控制 hCV感染有着重要意义。合成肽疫苗由于具有制备容易、可大量生产以及稳定、易保存、副作用少和使用较安全等优点，近几年得到了广泛重视。本文拟将 hCV合成肽疫苗的发展作一综述。


　　预防性疫苗


　　hCV在生物学分类上与动物的瘟病毒和人类的黄病毒相似。已知黄病毒非结构（ nS）蛋白和瘟病毒 gp33/gp55可刺激机体产生中和抗体，提示与其基因和疏水图非常相似的 hCV包膜蛋白可能是机体免疫攻击的靶。 choo等[1]曾用重组痘苗病毒在 heLa细胞中表达的 hCV包膜蛋白 e1和 e2接种7只黑黑猩猩，证实 hCV e蛋白诱生的抗体是中和性抗体，可以预防/阻止病毒持续感染，故能够作为预防性疫苗。 farci等[2]将一慢性 hCV感染者不同年代的血浆灭活，并与病毒混合后接种黑猩猩，以研究 hCV感染者体内是否有特异性中和抗体。结果发现，用该患者感染 hCV14年的血浆与病毒混和物接种的黑猩猩全部被感染，而用该患者感染 hCV2年的血浆与病毒混和物接种，黑猩猩未发生 hCV感染，因此作者认为在慢性 hCV感染者体内有 hCV准种和特异性中和抗体。随后该作者[3]以 hCVH77高变区1（ hVR1）合成的两条肽390～410和384～414氨基酸免疫家兔后得到抗 hVR1超免疫血清，然后给5只黑猩猩接种这种血清与不同 hCV准种 h77/H79混合物，结果显示抗-HVR1对同源 h77株有免疫防御作用，对混合的 hCV准种则无此作用，因此认为：中和抗体攻击的主要靶位是 e2/NS1的 hVR1，而且抗-HVR1的中和作用有病毒株特异性。


　　weiner[4]F发现 e2存在两个 hVR，并确定 hVR含有诱生中和抗体的表位。 rosa等[5]结合细胞荧光标记与流式细胞计数技术，建立了 hCVE2蛋白与靶细胞结合中和定量检测系统，结果提示至少存在两个中和性表位，一个是高度变异的，另一个存在于 e2的其他区域。 zibert等[6]以成纤维细胞（ vH3）研究体外阻断 hCV感染也发现抗-HVR1的中和作用有少部分存在交叉反应，不是所有抗-HVR都是株特异的；他们还观察到 hCV感染的早期即出现抗包膜糖蛋白上 hVR1的抗体可导致自限性感染，说明抗-HVR1具有保护作用，可以阻断 hCV感染的发展[7]。所有这些都提示中和抗体的攻击靶位是 e2/NS1的 hVR1，以 hCV包膜糖蛋白 hVR1为基础备预防性疫苗是可行的。


　　但是中和抗体识别的蛋白表位大多是不连续的，即中和性抗原表位大多是构象的，抗体识别的是构型而非组成它们的序列，这在对口蹄病毒（ fMDV）中具有诱生中和抗体的肽段的 x射线晶体分子衍射分析及其他一些试验得到证实[8]；最近的研究也表明 e1E2复合体上构型表位的形成对包膜糖蛋白诱导机体产生保护性免疫方面起着重要作用[9]。这就要求在合成 hCV包膜糖蛋白的多肽疫苗时不但注意所选择肽段的免疫原性，而且必须考虑免疫原性蛋白和其他蛋白质及核酸三者间的交互作用所涉及到的构象限制。因此，研究并模拟 e蛋白表位的构型和在细胞膜上的暴露状态，是最终制备有效疫苗的基础。


　　多抗原肽（ mAP）是以核心基质为交联体或树状臂，将若干条抗原表位相同或不同的单体肽偶联在一起，形成树枝结构，则不但可克服上述方法的不足，而且能很好模拟天然表位构象，具有明显的优越性，已经用于人类免疫缺陷症病毒（ hIV）、 fMDV、乙型肝炎病毒（ hBV）和疟原虫等多种病原体保护性抗原的分析和分子疫苗的设计。 mAP骨架仅含多个赖氨酸，能在确切的部位结合4条或8条多肽链，多肽链的分子量可占整个疫苗的95%；由于 mAP上肽链结合的数量及位置确切，制备的疫苗结构均一、纯度高， mAP与多肽的结构物免疫原性强，无需再偶联载体蛋白便能诱生高滴度、高亲和力的抗体，而 mAP本身没有免疫原性，故既能提高疫苗的质量又能去除载体蛋白的缺陷。


　　治疗性疫苗


　　由于目前也有学者认为 hCV感染后不能产生有效的保护性抗体，故细胞免疫在抗 hCV感染中的作用越来越受到重视。细胞毒性 t细胞（ cTL）是执行细胞免疫应答的主要效应细胞，属于 cD8+T细胞，当其表面受体（ tCR）与靶细胞的 hCV抗原结合后，在主要组织相容性复合物（ mHC）Ⅰ类抗原的介导下，通过溶解受感染的靶细胞达到清除病毒的目的，但同时亦可造成感染组织的损伤。研究表明，丙型肝炎患者的肝脏病理变化主要表现为汇管区淋巴细胞聚集和淋巴滤泡形成，在肝脏碎屑样坏死区以 cD4+细胞浸润为主，而在肝小叶区则以 cD8+细胞居多；急慢性 hCV感染者外周血和肝脏中特异性 cTL可以识别 hCV编码蛋白质中的一个或多个表位；人工合成的 hCV多肽，可在体外刺激 cTL增殖，并增强其溶解 hCV感染靶细胞的能力，因此 cTL在清除 hCV感染中可能起重要作用。


　　kita等[10]发现用 hCV核心区合成多肽反复刺激病人的外周血单个核细胞（ pBMC）后，能诱导 cD8+的特异性抗 hCV cTL，这种 cTL不但识别与 hLA-B44+分子相结合的核壳蛋白（ nP）81-100合成多肽，而且还能溶解 vAC-HCV感染的靶细胞。该作者[11]又用重组 hCVNP和合成的重叠肽作抗原对3例慢性丙型肝炎病人的 pBMC反复刺激，发现他们均可产生能识别 nP81-100序列的特异性、 hLA-B44+限制中 cTL；在1例病人中观察到能识别 nP1-120序列的外周血淋巴细胞，并证明其属 cD4+T细胞，主要识别 nP21-40表位和81-100表位，而 nP1-120和 th表位可在体外增强 hCV特异性 cTL产生。作者注意到此病人血液 hCV阴性，丙氨酸转氨酶（ aLT）水平也正常，而另两例存在 nP却无 cTL活性增强的病人，血液 hCV阳性， aLT水平升高。作者认为当持续感染 hCV时，尽管 cTL参与免疫病理损伤导致严重肝损伤，但可加速感染机体中 hCV的清除； th表位的存在不但可增强 hCVNP特异性 cTL反应性，而且可通过与 b表位的内在作用提高抗体水平，从而增加机体抵抗 hCV感染的免疫力。


　　lechmann等[12]对 hCV感染后不同转归的病人进行了体液和细胞免疫研究，共观察了10例抗 hCVA血清阳性的无症状献血者（ a组）和29例慢性丙型肝炎病人（ b组）血清中的抗体水平及对 hCV刺激后的淋巴细胞增殖应答，也发现了类似现象：（1） a组病例可出现较强的 t细胞增殖应答，但血中肽特异性抗体水平很低甚至检测不出；而 b组 b细胞应答较普遍；（2）通过在每组用同一肽刺激引起的增殖应答，可确定核心区至少存在5个不同的 cTL表位（20～44、39～63、79～103、118～152和148～172位氨基酸），而 e区有3个 cTL表位（198～252、308～372、368～392位氨基酸）。作者认为在血清抗-HCV阳性的无症状病人中抗体滴度低的原因可能与这些病人的强 t细胞效应抑制了病毒复制从而导致病毒抗原刺激的减弱或消失。


　　需要注意的是，尽管在感染者体内有特异性 cTL，但大部分 hCV感染者仍转为慢性。推测其原因可能有：（1）免疫选择压力造成了 cTL表位发生突变，导致特异性 cTL功能丧失；（2）机体大量淋巴细胞被 hCV感染，使机体免疫受损；（3）体内 hCV滴度太低，引起机体产生的 cTL应答太弱。目前倾向于认为 hCV基因高度变异发生免疫逃避，从而使感染持续存在。因此，探讨 cTL疫苗的交叉保护性无疑有着重要作用。


　　shirai等[13]发现含 hIVgp160多重表位的 th表位的合成肽与对 mHC选择性低的通用 th表位(promiscuous t epitopes)相似。为研究内源和外源 th表位对 cTL效应的影响，作者将合成的 nS5区的 cTL表位肽（ p17） n端与上述 hIV的通用 th表位偶联成一嵌合肽（ pCLUS3-17），并比较了其与全长核心区 cTL表位肽（ c7）、核心区含 cTL表位的部分区段（ c7A10）在 bALB/c小鼠体内诱生抗 hCV cTL的差异。结果显示 p17肽单独免疫小鼠所诱生的 cTL增殖效应明显比 pCLUS3-17弱，提示 p17肽中缺乏 th表位，而含 th表位的 c17能诱生很强的 cTL效应；同样，可能缺乏 th表位的 c7A10肽诱生的 cTL效应亦较弱。作者由此确信，无免疫原性的肽可通过嵌入合适的多 th细胞表位而改造成有免疫原性的肽；对缺乏内源性 th表位诱导活性的 cTL表位肽；应共价结合广谱 th表位；对已包含内源性 th表位的 cTL表位肽，加入上述广谱 th表位可扩充 mHC识别类型，这样可使疫苗的保护作用更有效。这无疑对构建免疫原性强，具有交叉保护作用的 cTL合成肽疫苗提供了很好的思路。


　　已经明确，病毒抗原中同时存在增强性和抑制性表位。为提高免疫保护作用，应努力提高增强性表位的作用，降低和摒除抑制性表位作用。就 hCV感染而言，研究 cTL增强性表位的报道较多，尚未见抑制性表位或增强性表位抗体对 cTL功能影响的研究，也就是注重了病毒抗原表位对 cTL功能的正性作用，而忽略了病毒抗原表位及其抗体对 cTL功能的负性影响，这样对阐述 hCV感染时 cTL功能缺陷存在片面性。因此，研究抗 hCVA抑制性表位或增强性表位抗体对 cTL功能的抑制作用，无疑可以从深层次上揭示 hCV感染对 cTL功能缺陷的原因，对 hCV感染时免疫耐受的形成和指导疫苗的研究均有重要意义。另外， mAP在 hIV、 fMDV、 hBV等保护性抗原分析和分子疫苗中的成功应用，对设计和制备 hCV疫苗是一个有益的启示。由 th表位、中和性表位和/或 cTL表位组成的并且有一定构象的大分子嵌合肽可能最终成为有效的疫苗。


　　参考文献


　　1 Choo QL et al.Proc Natl Acad Sci USA,1994;91(4):1294-1298


　　2 Farci Pet al.Proc Natl Acad Sci USA ,1994;91(16):7792-7796


　　3 Farci P et al.Proc Natl Acad Sci USA,1996;93(26):15394-15399


　　4 Weiner AJ et al.Proc Natl Acad Sci USA,1992;89:3468-3472


　　5 Rosa D et al.Rroc Natl Acad Sci USA,1996;93(5):1759-1763


　　6 Zibert A .Virology,1995;208:653-661


　　7 Zibert A et al.Hepatology,1997;25(5):1245-1249


　　8 Sesardic D.J Med Microbiol,1993;39(4):241-242


　　9 Deleersnyder V et al.J Virol,1997;71(1):697-704


　　10 Kita H et al.Hepatology,1993;18(5):1039-1044


　　11 Kita H et al.J Virol,1995;45(1):386-391


　　12 Lechmann M et al.Hepatology,1996;24(4):790-795


　　13 Shirai M et al.J Infect Dis,1996;173(1):24-31